多光子显微镜成像技能之二十三 根据单激光的同步四波长激起源驱动双光子荧光显微镜
数十亿神经元之间相互作用，使大脑呈现出杂乱的形状。研讨这样一个杂乱体系依赖于多色荧光成像和各种生物标志物，具有三种以上色彩的一起多色符号现已渐渐的变多地用于大脑研讨。例如，Brainbow是一种根据三个或四个荧光蛋白（FP）的多色符号技能，用于制作神经元的连通性。
开始，波长可调钛宝石（Ti：S）飞秒振荡器经常被用来顺次激起多个荧光符号。但是在波长调和谐重复扫描期间，较长的扫描时刻有几率会使样品不稳定，次序激起会使成像速度变慢。因而，火急地需求开发一种可以一起为双光子荧光显微镜（TPFM）供给多种激起波长的光源。
现有的一起多色激起源只可以经过非线性光学或光纤技能供给三个激起波长。最早是经过钛宝石激光同步泵浦OPO取得双波长，再加上双波长的和频来发生第三个虚拟激起波长［1］，完成三个FP的Brainbow成像。未处理根据固体激光器的体系尺度和本钱问题，现在有经过倍频高能掺铒光纤激光器出射的脉冲再加上运用大模场光子晶体光纤（PCF）红移脉冲来取得三波长［2］，以及经过高非线性PCF完成孤子自频移来发生三波长［3］，但没有较好的方法发生一起四波长的激光源。在Brainbow系列中具有最广泛的双光子吸收规模，而且广泛适用于各种安排和物种的腺相关病毒的4－XFP Brainbow （Brainbow AAV），需求一起激起四个荧光团，在 TPFM 中对应于蓝色TagBFP、青色mTFP、黄色EYFP 和赤色mCherry，峰值别离坐落810、870、970和1080 nm。因而，需求开发一个四波长的激起源。
2021年孙等人提出了用于TPFM的飞秒四波长激起源［4］。运用1，070 nm掺镱光纤飞秒激光器泵浦高非线性PCF（HNPCF），在弱负色散区域中的自相位调制（SPM）效应使光谱蓝移，左边发生两个光谱峰，中心波长别离在812和960 nm。经过将蓝移的光谱压缩到33 fs以保证812和960 nm这两个峰在时刻上堆叠，和频效应（SFG）会在886 nm 处发生第三个虚拟激起波长，结合1070 nm 的泵浦波长，该激起源总共能供给四个波长。
图1为四波长激起源的试验设备。掺镱光纤激光器发射48 fs的脉冲，中心波长为1070 nm，重复频率为70 MHz。运用非球面透镜和手动三轴载物台将该脉冲耦合到零色散波长为1040 nm的6．5 mm长的HNPCF中来完成光谱蓝移。然后经过半波片和偏振分束器进行功率调理来优化波长转化。进一步运用带通滤波器（BPF）从HNPCF的输出中挑选750–1000 nm的波长规模。滤出来的脉冲和1070 nm的脉冲别离由光栅对（图1（b））和棱镜对（图1（c））预啁啾，然后经过双色镜组合。HNPCF 输出脉冲包含812、886和960 nm，与1070 nm的泵浦脉冲结合来完成TPFM中的一起四色激起。
图1 四波长激起源的试验设备。HWP：半波片；PBS：偏振分束器；L：透镜；BPF：带通滤波器；PPC：棱镜对；GPC：光栅对；SDM：短通双色镜。
图2为不同长度的HNPCF得到的输出光谱，赤色虚线框显现了经过BPF滤波的光谱规模。从图中可以精确的看出经过缩短光纤能添加转化波长的功率，当HNPCF长度为6．5 mm时，泵浦功率为1179 mW，滤波后的功率为336 mW。此刻光谱有两个峰值，别离为812 nm和960 nm，对应于TagBFP的双光子吸收峰值和EYFP的双光子吸收峰值。进一步经过812 和960 nm的时刻堆叠发生886 nm的虚拟激起波长，来激起mTFP。
最终，运用33 fs的蓝移三波长脉冲和73 fs的1070 nm脉冲对4－XFP符号、80μm厚的表达TagBFP、mTFP、EYFP和 mCherry的小鼠脑切片进行成像。图3（a）－（f）和（g）－（l）别离是在小鼠脑切片的两个不同深度（20和34 μm）同一方位处取得的图画，显现了 mCherry（图3（a）和（g））、EYFP（图3（b）和（h））、mTFP（图3（c）和（i））和 TagBFP（图3（d）和（j））的荧光图画，以及叠加四种荧光图画发生的4－XFP Brainbow AAV的图画（图3（e）和（k））。
图3 4－XFP Brainbow AAV符号的小鼠大脑皮层切片的双光子荧光图画
总归，该课题组提出了一个根据飞秒掺镱光纤激光的四波长激起源，能在TPFM中进行一起高效的四色成像。
原文标题:多光子显微镜成像技能之二十三 根据单激光的同步四波长激起源驱动双光子荧光显微镜
